《食品科学》：河南工业大学布冠好教授等：大豆主要致敏蛋白及其检测技术研究进展

　　大豆中含有丰富的蛋白质及多种人体必需氨基酸，是一种重要的植物性蛋白资源，常被加工成各种食品。然而，大豆在部分国家是优先过敏原。据统计，大豆过敏影响了大约0.2%～0.4%的人群，其在儿童中的过敏率高达13%。大豆过敏是一种重要的食物过敏反应，会引发皮肤、呼吸道及消化道症状，如皮疹、荨麻疹、哮喘、腹泻、腹痛等，严重时可导致过敏性休克。

　　河南工业大学粮油食品学院邢玉飞，布冠好*，陈复生等对于大豆致敏蛋白特性的深入了解及研究快速、精确和标准化的过敏原检测方法具有重要的实际意义。

　　大豆蛋白可分为4 种主要蛋白质，分别为2S、7S、11S及15S球蛋白组分。大豆中已有38 种过敏原被识别，根据致敏蛋白的组分含量及其致敏能力的差异，β-伴大豆球蛋白、大豆球蛋白、Gly m Bd 30K、Gly m Bd 28K被列为主要致敏成分。

　　β-伴大豆球蛋白属于贮藏蛋白，属于7S球蛋白。由α’（～71 ku）、α（～67 ku）和β（～50 ku）3 种亚基 通过疏水相互作用及静电相互作用连接形成三聚体糖蛋白。3 种亚基随机组合形成3 种同三聚体 （如α3、α’3、β 3 ） 和7 种异三聚体（如 αα’2、α2α’、αα’α2、α’2β、α’β2、α2β、αβ2），其中β 3 的立体图如图1所示。研究发现这3 种亚基都有不同程度的致敏性，其中β-伴大豆球蛋白的α亚基能被23%的患者血清识别，并且这3 种亚基之间具有较高的同源性。其中，对于核心区，α与α’的同源性为90.4%，α与β的同源性为76.2%，α’与β的同源性为75.5%；而α和α’之间的延伸区具有57.3%的序列同一性。

　　大豆球蛋白也是一种贮藏蛋白，约占大豆总蛋白含量的19.5%～23.1%，其分子质量约为360 ku，属于11S球蛋白。大豆球蛋白由氢键连接的5 个主要亚基对组成，其主要亚基对根据氨基酸序列可以分为两组（组1包括A1aB1b、A1bB2、A2B1a；组2包括A3B4、A5A4B3），每个亚基对的分子质量约60 ku。目前已知的大豆球蛋白酸性多肽链有6 种：A1a、A1b、A2、A3、A4和A5，其分子质量为35～40 ku；碱性多肽链有5种：B1a、B1b、B2、B3和B4，其分子质量均为22 ku。除了A5A4B3以外，其他亚基对均由1 个酸性A肽链和1 个碱性B肽链通过二硫键组成A-S-S-B单体形式。酸性多肽链与碱性多肽链的结合并不是随机的，而是形成独特的酸性-碱性对 。Badley等利用电子显微镜和X射线散射技术，首次揭示了大豆球蛋白的四级结构，阐明大豆球蛋白的物理形状是一个低扁圆柱体，其尺寸为11.0 nm×11.0 nm×7.5 nm，其中两个三聚于另一个三聚体之上，从而形成大豆球蛋白六聚体。同时两个三聚体通过静电作用相互连接，而三聚体中的亚单元则主要通过疏水力结合。 迄今为止，仅有含A3B4亚单位的大豆球蛋白同型六聚体被确定了晶体结构，如图2所示。在不同的离子强度、pH环境及热处理条件下，大豆球蛋白可被解离为亚基、成分多肽和半分子形式，但是天然状态下大豆球蛋白的分子结构十分紧密，一般难以被酶解和催化。针对致敏性而言，大豆球蛋白的致敏性弱于β-伴大豆球蛋白，其中大豆球蛋白碱性多肽链的致敏性较弱，而酸性多肽链的致敏性较强，原因是酸性多肽链与IgE、IgM、IgA有较强的结合活性。

　　Gly m Bd 30K，又称P34，是一种半胱氨酸蛋白酶，广泛存在于大豆细胞液泡中。Gly m Bd 30K是单体蛋白，其氨基酸数量为379 个，分子质量为34 ku，属于7S球蛋白，约占大豆总蛋白含量的1%，其结构如图3所示。研究发现，66.5%的大豆过敏患者对Gly m Bd 30K识别并产生过敏反应，因此认为其属于大豆中的主要致敏蛋白。同时，Gly m Bd 30K是一种糖蛋白，其N端170位氨基酸处是一个多糖链结合位点。蛋白质的糖基化位置在其致敏性方面发挥重要作用，因此Gly m Bd 30K存在一定致敏性。

　　Gly m Bd 28 K是由473 个氨基酸残基组成的糖蛋白，主要存在于7S球蛋白中，约占大豆总蛋白含量的0.5%，其蛋白结构如图4所示。23%的大豆过敏患者可以对Gly m Bd 28K产生过敏反应，其致敏表位最主要反映在其N端氨基酸序列：FHDDEGGDKKSPKSLFLMSSTR，其多糖结合位点位于多肽链20位天冬酰胺处，该多糖由甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖、木糖及海藻糖以物质的量比3∶2∶1∶1组成。去糖基化后Gly m Bd 28K的致敏性完全消失。

　　根据识别物质的不同，目前食品过敏原的检测技术可分为基于蛋白水平和基于核酸水平的检测技术。基于蛋白质水平的检测技术包括酶联免疫吸附测定（ELISA）、免疫印迹法（Western blotting）、免疫层析法、质谱法及生物传感器法；基于核酸水平的检测技术有实时定量聚合酶链式反应（qPCR）、环介导等温扩增（LAMP）技术。

　　ELISA基于抗原-抗体的特异性结合对过敏原进行免疫测定，通过间接指标对过敏原含量进行定性或定量检测，不需要复杂或昂贵的设备。E LISA根据固定抗原方法的不同，可分为直接法和间接法，其中间接法包括夹心法及竞争法，不同ELISA方法的原理示意图如图5所示。夹心ELISA法检测灵敏度明显高于竞争性ELISA法，但更适合于未加工大豆蛋白的检测，而竞争性ELISA法则更适合检测加工后的大豆制品。基于单克隆抗体所建立的ELISA法检测精准度高于基于多克隆抗体的ELISA法。

　　免疫印迹法又称蛋白质印迹法，是基于抗体的特异性来鉴定抗原的有效检测方法。首先进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），随后将聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白质样品电转移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上。利用一抗作为“探针”，用标记的二抗进行“显色”，对样品进行检测与分析，免疫印迹法的具体步骤及原理如图6所示。免疫印迹法兼具电泳的高分辨力及免疫测定法的高特异性及敏感性等优点，可用于抗原的定性和半定量检测。相比于ELISA，免疫印迹法的灵敏度较低，对检测样品中的大豆过敏原仅能进行定性或半定量检测，但是其可以追踪不同食物加工阶段产物中所有蛋白和肽段图谱。此外，免疫印迹法可以有效避免由于蛋白抑制剂的存在导致的检测结果假阴性现象。

　　免疫层析法基于抗原-抗体的特异性结合，首先将抗体预包被于硝化纤维素（NC）膜上，待测样品通过毛细作用涌动到预包被抗体区域时被捕获，使用酶标或胶体金作为检测标志物，从而得到可视化结果，以纤维素膜上显色条带及其颜色的深浅等作为评价指标，从而实现过敏原的定性或定量检测，检测原理如图7所示。相比于ELISA法，免疫层析法虽然检测时间较短，但是其精准度较低。免疫层析法操作简单、用时较短，通过增加检测线（T线）可以进行高通量检测。为了有效提高免疫层析法的灵敏度，未来可以将单克隆抗体与新型材料标志物如荧光量子点相结合。

　　生物传感器通过生物识别元件识别并响应食物中的过敏原，再由换能器将其转化为定量的光电信号来实现检测，其工作原理如图8所示。根据换能器的不同，生物传感器可以分为光学生物传感器、电化学生物传感器及压电传感器三类。作为一类新的检测方法，它具有快速、灵敏度高、自动化程度高、实时监测等优点，近年来已被广泛应用于食物过敏原方面的检测。生物传感器技术兼具免疫检测技术及光电技术的优点，在大豆过敏原检测中，选用最佳生物传感器并扩大检测范围是未来的发展热点之一。

　　液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）法检测的基本原理是样品通过离子源从而被电离成不同带电粒子，利用加速电场使带电粒子进入质量分析器，接着在电场及磁场的双重作用下，将不同质荷比（m/z）的离子分离并计算其分子质量，最后通过计算机对蛋白质或肽段进行鉴定分析，其工作原理如图9所示。质谱方法虽然克服了免疫学技术遇到的问题，即在食品加工处理后导致蛋白质的结构发生变化后，无法有效、精准地检测过敏原，但其需要使用昂贵的设备，维护成本很高，而且需要由训练有素的人员操作。现阶段，由于质谱法具有检测灵敏度高、检测时间短、检测用量少及可进行分离鉴定等特点，已广泛应用于大豆过敏的检测中。

　　PCR技术是一种在体外将少量初始样品中的目的基因进行大量扩增的核酸合成技术。随着荧光化学物质的发展，基于其荧光特性实时定量监测扩增过程即为qPCR技术，其利用体外大量扩增的核酸产物来进行样品检测。可在PCR体系中加入荧光基团，通过所产生的荧光信号变化来动态监测整个反应过程。qPCR是在食品过敏原检测中应用最为广泛的一项基因水平检测技术。qPCR的特异性和灵敏度均优于普通PCR，在进行定性分析的同时，实现了在复杂食品基质中对多重过敏原的定量分析。利用PCR检测大豆过敏原容易出现假阳性或假阴性结果，因此PCR在大豆过敏原检测中的应用有所局限。

　　LAMP技术是根据6～8 种不同的靶基因DNA序列开发设计出4～6 种特异性引物，60～65℃恒温下在链置换DNA聚合酶作用下进行大量扩增，短时间内可实现靶基因的特异性显著扩增。LAMP的分析检测结果通过反应体系中样品颜色等变化进行评估。与传统的PCR和qPCR检测方法相比，LAMP具有许多优点，如恒温扩增、反应时间短、检测结果可通过肉眼判断等。该方法最主要的难点在于引物的设计，其直接决定了检测方法的准确性。基于DNA的LAMP-侧向流动免疫法是一种操作简单的大豆致敏原检测方法，其显示出比商业侧向流动免疫法更高的灵敏度及特异性。

　　随着全球范围内食品多样性的增加，食品中可能含有的过敏原含量及种类不断上升，检测难度不断升高，总结和认识现有检测方法的优势与不足（表1），对于食品中不同过敏原的快速精准检测具有重要作用。

　　在全球范围内，食物过敏尚无特效疗法，但大豆过敏患者人数逐年升高。由于大豆具有较高的营养价值及良好的功能特性，且其在食品工业中应用广泛，所以明确大豆中的主要致敏蛋白及其结构，建立灵敏、高效的检测方法对于预防大豆过敏相当重要。目前应用的检测技术中，ELISA、质谱技术及qPCR检测方法应用最为广泛，但是检测结果容易受到食品加工技术及食品基质的影响。此外，食品加工过程中过敏原的分子结构变化、样品前处理中的有机溶剂残留等因素均会影响抗原-抗体的特异性结合，导致检测结果不准确。由于食品在加工、包装、运输过程中可能发生交叉污染，所以精准检测复杂食品基质中的隐藏过敏原成分极为重要。随着食品工业的快速发展，研究高通量且可现场检测的方法十分必要。在现有检测技术的基础上，应用新型生物传感器及纳米材料开发出便捷、高效、精准的过敏原检测技术极具实际意义。

　　布冠好，教授，博士生导师，河南省高等学校青年骨干教师，新加坡国立大学访问学者。毕业于中国农业大学农产品加工及贮藏工程专业，获工学博士学位。主要从事食品蛋白质资源开发与利用、食品蛋白质构效关系、食物蛋白过敏原调控及检测技术等领域的研究。先后主持国家自然科学基金青年基金项目、国家自然科学基金面上项目、中国博士后科学基金面上项目、河南省科技攻关项目、河南省教育厅项目、郑州市科技协同创新专项等项目12 项，参与国家重点研发计划课题2 项。在国内外期刊上发表学术论文60余篇，其中SCI收录论文17 篇，EI收录论文6 篇，ESI高被引论文1 篇。获得河南省自然科学优秀学术论文一等奖1 项、黑龙江省科技进步二等奖1 项，授权国家发明专利3 项。